Les tests de terrain pour la détection des agents biologiques et chimiques dans le NRBCe

La détection 

Les premiers secours peuvent être amenés à identifier rapidement le contenu d’un produit chimique et/ou biologique répandu sur une surface afin de prendre les mesures de protection et de décontamination adéquates. C’est le cas par exemple d’une poudre blanche contenue dans une enveloppe.

Il existe sur le marché un certain nombre de systèmes reposant sur des principes différents et dont la sensibilité et la spécificité ne sont pas toutes équivalentes.

Les systèmes les plus simples détectent uniquement la présence de protéine, d’autres, basées sur des réactions immunologiques, identifient très exactement le produit. Les plus performants sont basés sur le principe de la PCR (Polymerase Chain Reaction). Bien évidemment, les coûts sont faibles pour un produit simple et beaucoup plus élevés pour les produits plus techniques.

Les poudres suspectes

Les  poudres suspectes les plus souvent rencontrées sont de différentes natures :

• organiques biologiques : levure de boulangerie, insecticide biologique (Bacillus thuringiensis) ;
• organiques contenant des protéines : lait en poudre, farine… ;
• organiques sans protéine : pectine, sucre, maïzena (amidon de maïs)… ;
• inorganique : poudre à laver, sulfate de magnésium, talc, kaolin…

Les indicateurs biologiques généraux

Indicateurs colorés

D’un abord très simple, ces systèmes sont capables de détecter des protéines à l’aide d’un indicateur coloré qui change de couleur en leur présence. Un prélèvement est réalisé à l’aide d’un écouvillon par exemple et introduit dans un tube de réactif. Le temps de réaction est court, généralement de 1 à 5 minutes.

La présence de protéine peut révéler la présence d’un produit biologique dangereux (spore de Bacillus …) ou d’une toxine (Ricine, toxine bactérienne…). Certains tests ne détectent que les protéines (INDIPRO), d’autres associent la mesure du pH- les agents biologiques dangereux ne sont généralement actifs qu’à des pH neutres (BioCheck® Powder Screening Kit), d’autre détectent aussi la présence d’amidon – souvent issu d’un produit alimentaire- (TASKit BioScreener™).

L’ ATP

L’adénosine triphosphate est un métabolite caractéristique des cellules vivantes et sa quantité est proportionnelle au nombre de cellules. L’échantillon doit subir une préparation laquelle, pour les mesures de terrain, est limitée au strict minimum. Les cellules doivent être lysées pour libérer l’ATP. Une filtration permet de concentrer l’échantillon (PROFILE® 1). Le système enzymatique est constitué du substrat (luciférine) hydrolysé par l’enzyme (luciférase) en présence d’ATP et d’O2. La réaction produit de la lumière qui est mesurée par un microluminomètre transportable. Les spores de Bacillus ne contenant que très peu d’ADN il est nécessaire de les faire germer au moins 15 minutes sur un milieu de culture. En revanche, il y aura des faux positifs avec de la poudre contenant des cellules vivantes comme des levures ou des spores de Bacillus thuringiensis contenues dans les insecticides. Bien sûr, ni la ricine, ni les toxines ne donneront de signal car ce ne sont pas des cellules vivantes.

L’ ADN

Des systèmes sont capables de détecter l’ADN (ou de l’ARN double brin) au moyen d’un colorant fluorescent qui se fixe spécifiquement dessus. Prime Alert® demande un minimum de préparation mais nécessite l’utilisation d’un microfluorimètre et la constitution d’une gamme étalon.

La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

C’est une méthode spectroscopique initialement utilisée pour identifier rapidement la composition chimique d’un produit inconnu. Le spectre protéique obtenu est comparé à ceux d’une base de données. TruDefender® FT and FTi est un appareil portable capable de communiquer avec la base de données. Le système n’est pas adapté à l’identification des agents biologiques.

La PCR

Il existe des appareils de terrains comprenant à la fois le système d’échantillonage, de préparation de l’échantillon et le thermocycleur. Ils fonctionnent sur piles. Nous ne citerons  FilmArray®, BioFire Diagnostics, Inc. qui est capable d’identifier 17 agents en 60 minutes et T-COR 4™ Tetracore, Inc. qui en identifie 19 en 45 minutes. Cette technique est de loin la plus sensible et la plus spécifique mais aussi la plus onéreuse…

Avantages et inconvénients des indicateurs biologiques généraux

Ils mettent en évidence une grande quantité de matériels biologiques et organiques. Mais, en aucun cas, ils ne confirment la présence d’un agent de la menace. Leur spécificité est relativement basse ce qui entraîne la présence d’un grand nombre de faux négatifs. En revanche ils sont très utiles comme outil de screening lorsqu’il y a beaucoup de matériel différents à tester. Ils nécessitent néanmoins une confirmation par des tests plus spécifiques. Les protéines détectées sont présentent dans toutes les cellules, (anthrax, cellules humaines, bactéries non pathogènes) ainsi que dans des produits de consommation courants comme le lait infantile.

Les immunoassays

Les tests les plus simples sont basés sur le système de la chromatographie sur une bande nitrocellulose avec lecture à l’œil nu.

Le prélèvement contenant l’agent de la menace, est mis en contact avec des anticorps spécifiques marqués par un colorant. Une migration chromatographique dans un tampon fait progresser l’ensemble sur la bande de nitrocellulose vers une zone sur laquelle sont fixés des anticorps correspondant à l’agent. Ils vont donc s’y fixer en produisant une bande colorée puisqu’ils ont emporté avec eux les anticorps marqués. La migration se poursuit et les anticorps marqués en surplus vont se fixer eux-mêmes un peu plus loin sur des anticorps anti-anticorps déposés sur la nitrate de cellulose en produisant une deuxième zone colorée dite contrôle.

Sur la première ligne, dite « test », se fixent le produit recherché fixé aux anticorps marqués. Sur la deuxième ligne « contrôle », se fixent les anticorps marqués en surplus. La positivité de cette ligne contrôle est importante car elle montre que les différents acteurs de la réaction : antigène (agent de la menace) et leurs anticorps sont dans les bonnes proportions.

Un test positif se caractérise donc par la présence d’une ligne test colorée ET de la ligne contrôle colorée.

Les différents systèmes existants sur le marché différent en fonction des agents recherchés, de la sensibilité (plus petite quantité détectée), de la spécificité (faux positif ou faux négatifs) et du système de prélèvement.

Il existe des systèmes comme RAID 5 et RAID 8 d’ Alexeter Technologies qui contiennent respectivement 5 et 8 tests. Le système BioThreat Alert® Test Strips de Tetracore, Inc. peut détecter 9 agents mais sur des bandes différentes. Pour ce produit un lecteur optique permet d’optimiser l’interprétation. Pro Strips™ d’ AdVnt Biotechnologies, LLC détecte 5 agents sur la même plaque. Smart™-II de New Horizons Diagnostics, Inc. détecte 6 agents de manière séparée. NIDS® de ANP Technologies, Inc. peut détecter 3, 4 ou 5 agents en fonction de la configuration du système.

Rapid Analyte Measurement Platform (RAMP®) détecte 4 agents dont la variole est aussi basé sur un système chromatographique mais les agents colorés sont fluorescents ce qui implique obligatoirement l’utilisation d’un lecteur. Quant au CANARY® Zephyr de PathSensors, Inc. est basé sur  un système d’immunoessais cellulaire. Il utilise des lypmphocytes B imunocompétants, spécifiques des agents de la menace. L’agent se fixant sur les récepteurs spécifiques de la cellule B déclenche la libération de lumière par une protéine bioluminescente à l’intérieur de la cellule. Ce système nécessite un appareillage complexe, comprenant un lecteur de fluorescence,  un micro-ordinateur et une microcentrifugeuse.

Lecture et interprétation

La réalisation d’un test rapide sur le terrain n’est pas une chose facile : effectuer le prélèvement, mettre la réaction en route, laisser le temps nécessaire à la réaction, lecture du résultat final. Ces différentes étapes ne sont pas aisées à réaliser surtout lorsqu’on est équipé d’un EPI. De plus, il faut faire très attention à l’interprétation.

Quelques exemples

• la mise en évidence d’une protéine dans une poudre organique peut porter à confusion (faux positif) ;
• un immunoassay n’est valable que si les 2 zones colorées sont présentes ;
• les immunoassays ont tous des limites de détection dont il faut bien évidemment tenir compte (en dessous on peut être en présence d’un faux négatif) ;
• il peut exister des réactions croisées comme entre les spores de B. anthracis et d’autres Bacillus commensaux
• Comme tous les réactifs biologiques les réactifs sont sensibles aux conditions de conservation
• …

Une étude comparative de tous ces systèmes étudiant leur capacité à détecter et identifier les spores de Bacillus anthracis et la ricine vient d’être publiée.

Rachel A. Bartholomew et al. Evaluation of immunoassays and general biological indicator tests for field screening of Bacillus anthracis and ricin. Health Security, 2017, 15, 81-95.

DOI: 10.1089/hs.2016.0044

Conclusion

Sur le marché il existe un grand nombre de systèmes utilisables sur le terrain et capables d’identifier rapidement les agents de la menace. Ils sont caractérisés par leur sensibilité et leur spécificité. Il faut aussi tenir compte de la façon dont on réalise le prélèvement, des capacités d’identification dans les différents milieux ou poudres souvent utilisés pour leur dispersion et de la lecture, soit à l’oeil nu, soit à l’aide d’un lecteur optique. Il est aussi évident que les prix sont fonction du nombre d’agent détectés en même temps et de l’utilisation ou non d’un appareil de lecture, de la technologie mise en oeuvre…

Cela me fait rappelle la remarque d’un étudiant devant une poudre blanche suspecte qu’il était chargé d’analyser : « ce n’est pas du  bacille du charbon car la poudre est blanche  »  Méfions nous des apparences !

Auteur : Professeur François Renaud